全基因组亚硫酸氢盐测序是如何工作的？
测序技术的最新进展使得全基因组测序变得更加普遍和快速。全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)是这样一种下一代测序技术，它允许用户以单碱基分辨率分析DNA甲基化。DNA甲基化是一种调节基因表达的表观遗传机制，在疾病和癌症等生物领域有应用。
甲基化对多种生物学功能至关重要，并在某些疾病状态中发挥作用。基因表达通过招募蛋白质或抑制转录因子与DNA的结合来调节DNA甲基化。它发生在发育过程中，当细胞分化时，它有助于调节组织特异性转录。
WGBS将序列的亚硫酸氢钠转化与高通量DNA测序相结合。亚硫酸氢钠反应保护甲基胞嘧啶不被转化，而未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶。PCR后，它们被转化为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶将作为胞嘧啶出现。甲基胞嘧啶是胞嘧啶碱基的甲基化形式。这是通过将甲基转移到胞嘧啶的C5位置来实现的。
单核苷酸多态性(SNP)基因分型或下一代测序经常用于询问单个CpG位点的DNA甲基化。CpG位点是由一个磷酸基团分离的胞嘧啶和鸟嘌呤，称为CG位点。人类甲基体中含有大约2800万个CG位点。还有非CG甲基化位点:CHG或CHH，其中H代表腺嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶。
亚硫酸氢盐转化后可以构建基因组文库。使用WGBS的首批实验之一发现，在过滤以确保基因组文库的准确性之后，它们覆盖了理论上可以覆盖的所有胞嘧啶的大约93%。这类似于单个基因座的传统亚硫酸氢盐测序实验中所见的经典覆盖率。
然而，亚硫酸氢盐转化的测序文库显示非常低的多样性，因为出现的碱基主要是腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶，胞嘧啶的比例非常小。这是因为出现的胞嘧啶只是甲基化的胞嘧啶，而未甲基化的胞嘧啶已经转化为胸腺嘧啶。
对整个基因组测序通常相当昂贵。因此，尽管它已经应用于人类基因组等大基因组，但大量个体样品很少测序。已为此开发了代表性降低的亚硫酸氢盐测序(RRBS)，其中亚硫酸氢盐反应发生，但测序限于基因组的约1%。这使得几个个体的基因组测序成为可能。
已经发现，在高通量测序应用中，DNA片段扩增中存在GC含量偏差。与未甲基化的DNA相比，亚硫酸氢盐转化和PCR后甲基化的DNA将具有更高的GC含量，这意味着在构建测序文库时可能存在甲基化DNA的过量表达。
此外，随着PCR过程中循环次数的增加和用于PCR扩增的酶的作用，也注意到甲基化DNA的过度表达。研究建议在PCR过程中限制循环次数，并使用最佳聚合酶扩增文库。
一些方法试图在构建DNA测序文库时避免PCR扩增。然而，这对于用亚硫酸氢盐处理的DNA来说并不奏效，因为尿嘧啶将抑制簇形成。需要试剂，包括对尿嘧啶敏感的DNA聚合酶。这就是尿嘧啶在WGBS PCR过程中转化为胸腺嘧啶的原因。
亚硫酸氢盐处理过的DNA中的尿嘧啶被不同PCR周期的DNA扩增所取代。此外，大多数方案需要更高的输入量，因为亚硫酸氢钠处理可降解DNA，导致对可测序样品的限制。
为了提高WGBS的准确性，研究人员正在开发使用一个以上亚硫酸氢盐阅读地图的程序。这已证明通过减少读取异质性对检测甲基化DNA的影响从而有助于WGBS数据的全面测序来提高检测的准确性。
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